CPEB1

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 416 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Eine Autorenkorrektur zu diesem Artikel wurde am 6. Februar 2023 veröffentlicht

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Die molekularen Ursachen für die Verschlechterung der Eizellenqualität im Laufe des Alterns sind nur unzureichend geklärt. Da die Entwicklungskompetenz der Eizellen auf posttranskriptionellen Regulierungen beruht, haben wir getestet, ob eine fehlerhafte mRNA-Translation zu diesem Qualitätsverlust beiträgt. In alten Eizellen kommt es zu einer Störung der Ribosomenbeladung der mütterlichen Transkripte. Mithilfe eines Kandidatenansatzes detektieren wir eine veränderte Translation von 3'-UTR-Reportern und eine veränderte Poly(A)-Länge der endogenen mRNAs. Die mRNA-Polyadenylierung hängt vom zytoplasmatischen Polyadenylierungsbindungsprotein 1 (CPEB1) ab. Die Cpeb1-mRNA-Translation und die Proteinspiegel sind in alten Eizellen verringert. Dieser Rückgang führt zu einer Unterdrückung der Ccnb1-Translation in ruhenden Eizellen, einer vorzeitigen CDK1-Aktivierung und einem beschleunigten Wiedereintritt in die Meiose. Die Unterdrückung von Ccnb1 wird durch Cpeb1-mRNA-Injektion in alte Eizellen korrigiert. Die oozytenspezifische Cpeb1-Haploinsuffizienz in jungen Eizellen rekapituliert alle Translationsphänotypen alter Eizellen. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Funktionsstörung im Eizellen-Translationsprogramm mit der Verschlechterung der Eizellenqualität während des Alterns verbunden ist.

Der Verlust der Homöostase und die verminderte Fähigkeit, auf Stoffwechselprobleme zu reagieren, sind ein Kennzeichen der Zellalterung1. Allerdings verläuft der altersbedingte Rückgang der Zellfunktionen nicht in allen Zellen und Geweben des Körpers synchron. Ein markantes Beispiel ist der Eierstock, wo eine altersbedingte Abnahme der Anzahl und Qualität der Eizellen zu einem Rückgang der Fruchtbarkeit führt, der anderen altersbedingten Funktionsverlusten vorausgeht2. Obwohl ältere Patientinnen mit einer Eizellenspende eine Schwangerschaft austragen können3,4, ist der Rückgang der Eizellenentwicklungskompetenz eine große Hürde im Bereich der assistierten Reproduktionstechnologien (ARTs). Die Verschlechterung der Eizellenqualität wird auf mehrere Ursachen zurückgeführt, wobei am häufigsten eine erhöhte Inzidenz von Aneuploidie der Eizelle oder des Embryos und eine möglicherweise durch epigenetische Fehler oder metabolische Beeinträchtigungen verursachte genomische Instabilität gemeldet werden5,6,7.

Die Fähigkeit der Eizelle, sich als Embryo zu entwickeln und eine Schwangerschaft durch eine Lebendgeburt zu unterstützen, hängt von einer Reihe komplexer Entwicklungsprozesse ab, einschließlich des koordinierten Erwerbs der meiotischen und zytoplasmatischen Kompetenz der Gameten8,9. Weniger klar ist die Rolle der zytoplasmatischen Kompetenz beim Rückgang der Fruchtbarkeit mit zunehmendem Alter. Die zytoplasmatische Reifung umfasst den Aufbau der molekularen Maschinerie, die für den Abschluss der Meiose, für die Neuprogrammierung der Organellenmorphologie und deren Umverteilung innerhalb der Eizelle erforderlich ist. Es sollte betont werden, dass bei der Befruchtung das Zytoplasma der Eizelle auf die Zygote übertragen wird. Daher findet die Transkriptionsaktivierung des Embryonengenoms in dieser mütterlichen Umgebung statt9,10,11. Mehrere Beobachtungen in der ART-Praxis deuten darauf hin, dass eine mangelhafte zytoplasmatische Kompetenz eine Ursache für die verminderte Entwicklungs- und Implantationsfähigkeit des Embryos ist12.

Die Reifung der Eizellen ist der letzte Schritt der Oogenese. Innerhalb weniger Stunden tritt eine in der Prophase I arretierte Eizelle (auch Eizelle im Keimbläschenstadium (GV) genannt) als Reaktion auf den Anstieg des luteinisierenden Hormons (LH) wieder in die Meiose ein und durchläuft einen Kernhüllenabbau (NEBD oder Germinalvesikelabbau, GVBD). ), schließt die erste meiotische Teilung ab und kommt schließlich im MII-Stadium der Meiose zum Stillstand. MII-Eizellen haben dann den Eisprung und sind bereit für die Befruchtung. Die Entfernung einer durch GV blockierten, ausgewachsenen Eizelle aus dem Antrumfollikel löst eine Kaskade von Ereignissen aus, die als spontane Reifung bezeichnet werden und die Reifung bis zum MII-Stadium in vitro rekapitulieren. In diesen letzten Stadien der Eizellenreifung beruht die Synthese von Proteinen, die für die Entwicklungskompetenz entscheidend sind, auf einem Programm der zeitlich abgestimmten Übersetzung langlebiger mRNAs, die bereits früher während des Eizellenwachstums synthetisiert wurden13,14,15. Daher wird die Genexpression in Eizellen eher durch die Translation im Zytoplasma als durch die Transkription im Zellkern gesteuert. Diese Eigenschaft, die den Gameten der meisten Arten gemeinsam ist16, zeigt deutlich, dass das beim Übergang von der Eizelle zur Zygote ausgeführte Translationsprogramm ein wesentlicher Bestandteil des Erwerbs von Entwicklungskompetenz ist. Wir haben Beweise dafür geliefert, dass Fehler im Übersetzungsprogramm mit einer beeinträchtigten Entwicklungskompetenz der Maus verbunden sind17,18,19. Ein zentraler Mechanismus der Translationsregulation maternaler mRNAs beruht auf der dynamischen Modulation des Poly(A)-Schwanzes, der mit der 3'-untranslatierten mRNA-Region (3'-UTR)20 verbunden ist. Ein wichtiger Regulator der Polyadenylierung ist das zytoplasmatische Polyadenylierungselement-Bindungsprotein 1 (CPEB1)20,21. Dieses RNA-bindende Protein moduliert die Translation von mRNAs, die das zytoplasmatische Polyadenylierungselement (CPE) enthalten. Unsere genomweite Analyse ergab einen globalen Wechsel in der mütterlichen mRNA-Translation, der mit dem Wiedereintritt der Eizelle in den meiotischen Zellzyklus zusammenfällt, und die entscheidende Rolle von CPEB1 bei der Steuerung dieses Wechsels15.

Hier schlagen wir die Hypothese vor, dass eine fehlerhafte Ausführung des mütterlichen mRNA-Translationsprogramms während der Eizellenreifung auch zu einer beeinträchtigten Entwicklungskompetenz führt, die während des mütterlichen Alterns beobachtet wird. Im Gegensatz zu den zahlreichen veröffentlichten transkriptomischen Studien zur Eizellenalterung22,23,24,25 liegen kaum Informationen darüber vor, ob Defekte im Übersetzungsprogramm zum altersbedingten Rückgang der Eizellenqualität beitragen26,27. Mithilfe einer RiboTag-Immunpräzipitationsstrategie (IP)28 in Eizellen von Mäusen29 haben wir die Ribosomenbeladung in MII-Oozyten von jungen und alten Mäusen verglichen. Wir liefern Hinweise auf Defekte im mRNA-Translationsprogramm in Eizellen, die von alten weiblichen Mäusen stammen, eine Störung, die mit einer verminderten CPEB1-Funktion verbunden ist. Diese Defekte wiederum tragen wahrscheinlich zum Rückgang der Entwicklungskompetenz und zur altersbedingten Unfruchtbarkeit bei.

Frühere Studien haben das Transkriptom in ruhenden (GV) und reifen (MII) Eizellen von jungen und alten Mäusen untersucht (Datensatz GDS3295)24. Eine Schlussfolgerung dieser Studie ist, dass eine signifikante Anzahl von Transkripten in alternden Eizellen verringert ist24. Unsere erneute Analyse dieser Datensätze zeigt jedoch auch, dass die Konzentration der 2109-Transkripte in jungen Eizellen von GV zu MII signifikant ansteigt (ergänzende Abbildung 1a). Die Reifung von Eizellen bei Mäusen findet praktisch ohne Transkription statt, da voll ausgereifte Eizellen ein hochkondensiertes Chromatin aufweisen und die RNA-Synthese auf Hintergrundniveau erfolgt13. Angesichts dieser genomweiten Transkriptionsstilllegung sollten die mRNA-Spiegel in reifenden Eizellen nur stabil bleiben oder abnehmen, wobei die Abnahme durch Destabilisierung/Abbau verursacht wird15,30. Daher nehmen wir an, dass der weit verbreitete Anstieg der Transkriptmengen auf eine Tendenz zu polyadenylierten mRNA-Spezies zurückzuführen ist, die während der cDNA-Synthese unter Verwendung von Oligo(-dT)-Primern eingeführt wurden, eine Möglichkeit, die auch in der Originalveröffentlichung angesprochen wurde24. Der offensichtliche Anstieg der mRNA-Spiegel würde dann Unterschiede in der Polyadenylierung/Translation und nicht die mRNA-Steady-State-Spiegel widerspiegeln, eine Möglichkeit, die auch in anderen Oozyten-Transkriptomstudien vorgeschlagen wurde31,32. Tatsächlich zeigt ein Vergleich der scheinbar erhöhten Transkripte in GDS329524 mit unseren Datensätzen zur Untersuchung der Ribosomenbeladung 14 eine erhebliche Überlappung mit aktivierten mRNAs (ergänzende Abbildung 1a – c). Darüber hinaus bestätigt die direkte Messung der Poly(A)-Länge und der Effizienz des Oligo(-dT)-Primings eine solche Korrelation (ergänzende Abbildung 2). Die offensichtlichen Unterschiede zwischen jungen und alten Eizellen im alternden Transkriptom können daher eher auf eine fehlerhafte Polyadenylierung (ergänzende Abbildung 1d) als auf veränderte Transkriptwerte hinweisen.

Um diese Möglichkeit direkt zu beurteilen, verglichen wir Transkriptom und Translatom in MII-Oozyten von jungen (1 Monat) und alten (12–15 Monate) Mäusen unter Verwendung der RiboTag IP/RNA-Seq-Ribosomenladestrategie29 und der zufälligen Priming-Bibliotheksvorbereitung. Die Eigenschaften der Eizellenproben sind in der ergänzenden Abbildung 3a – e aufgeführt, und die Analyse der Datenqualitätskontrolle der RNA-Seq-Daten ist in der ergänzenden Abbildung 4a, b dargestellt. Mit Ausnahme von 47 mRNAs unterschieden sich die gesamten mRNA-Spiegel (Eingabe) zwischen jungen und alten MII-Oozyten nicht signifikant (FDR <0, 05, Abb. 1a). Umgekehrt war die Ribosomenbeladung in alten Eizellen im Vergleich zu jungen Eizellen bei 254 mRNAs signifikant verringert und bei 38 mRNAs erhöht (FDR < 0,05. Abb. 1b). Die Liste der signifikant unterschiedlichen Input- und HA-Gene finden Sie in den Zusatzdaten 1 und 2. Durch die Lockerung der statistischen Stringenz auf FDR < 0,1 erhöhte sich die Anzahl der mRNAs mit signifikant veränderter Ribosomenbeladung auf 726. Die genontologische Analyse der verringerten und erhöhten mRNAs zeigte eine Anreicherung in Begriffen, die „Mitochondrium“ und „Kern“ umfassen (Abb. 1c). Eine weitere Analyse der Daten ergab, dass die Translationseffizienz für eine erhebliche Anzahl von mRNAs, die mitochondriale ribosomale Proteine ​​kodieren, in alten Eizellen im Vergleich zu jungen gestört ist, obwohl die Eingabemengen vergleichbar sind (Abb. 1d). Für mehrere Gewebe eines alternden Organismus wurde über eine Veränderung der mRNA-Translation mitochondrialer ribosomaler Proteine ​​berichtet33,34,35, und eine Funktionsstörung der Mitochondrien während des Alterns ist gut belegt36, auch für die Eizellen37. Somit hat unsere RiboTag IP/RNA-Seq-Analyse Veränderungen erkannt, die nachweislich mit dem Altern zusammenhängen, und lieferte einen Hinweis darauf, dass in alten Eizellen eine Störung der mRNA-Translation vorliegt.

MII-Oozyten wurden von jungen und alten RiboTagF/F;Zp3-Cre-Mäusen gesammelt und RiboTag IP gefolgt von RNA-Seq wurde wie unter „Methoden“ beschrieben durchgeführt. Es werden zwei biologisch unabhängige Proben verwendet. a, b MA-Diagramm der Genexpressionsänderungen für Gesamttranskripte (a) und Ribosomenbeladung auf Transkripten (b) werden berichtet. Die log2-fachen Änderungen für junge vs. alte Eizellen werden auf der y-Achse aufgetragen und der log10-Wert der durchschnittlichen Zählungen pro Million Lesevorgänge (CPM) wird auf der x-Achse angezeigt. Jedes Gen wird durch einen Punkt dargestellt. Gene mit FDR < 0,05 werden rot (hochreguliert) oder blau (herunterreguliert) angezeigt. c Genontologische Analyse von mRNAs, deren Translation zwischen jungen und alten Eizellen signifikant unterschiedlich ist (FDR < 0,1), einschließlich hochregulierter und herunterregulierter Transkripte. Beachten Sie die äußerst signifikante Anreicherung der Mitochondrien. d Vergleich der Mengen an mRNAs, die für mitochondriales ribosomales Protein kodieren, und ihrer Translationseffizienz (TE) in jungen und alten Eizellen. Auf der Y-Achse ist der log2 des durchschnittlichen CPM aufgetragen. Der Balken stellt den Mittelwert \(\pm\) SEM dar. Eine Untergruppe der mRNAs, die für mitochondriale ribosomale Proteine ​​kodieren, wird in alternden Eizellen nur unzureichend translatiert. *FDR < 0,05. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Zur besseren Charakterisierung der mit dem mütterlichen Alter verbundenen Translationsdefekte verwendeten wir einen Kandidatengen-Ansatz. Um die umfassenden Veränderungen zu erfassen, die im vorherigen Alterungstranskriptom vorgeschlagen und durch RNA-Seq erkannt wurden, haben wir die folgenden Gene in die analysierten Kandidaten aufgenommen. TPX2 wurde als Kontrolle verwendet und unterschied sich im Alterungstranskriptom und in unserer RNA-Seq. nicht signifikant. NLRP5 (MATER), ein Bestandteil des subkortikalen mütterlichen Komplexes38, für den ein Anstieg in der RNA-Seq und im Alterungstranskriptom festgestellt wurde, wurde als prototypische hochregulierte mRNA während des Alterns verwendet. Golph3, Il7 und Thumpd1 wurden als repräsentative herunterregulierte mRNAs verwendet, wobei in einem oder beiden Datensätzen eine Abnahme festgestellt wurde. GOLPH3 ist ein Bestandteil des Golgi-Apparats, einer Organelle, die während der Eizellenreifung eine umfassende Umstrukturierung erfährt39. THUMPD1 kodiert für ein RNA-bindendes Protein, das an der Acetylierung von RNA und der Ribosomenbiogenese beteiligt ist40. Wir haben zuvor gezeigt, dass die Translation von IL7-mRNA und die Proteinsekretion während der Eizellenreifung zunehmen und dass ihre Anreicherung in der Follikelflüssigkeit (FF) von Patienten mit In-vitro-Fertilisation (IVF) mit der Eizellenreifung und der Eizellenqualität korreliert41. Angesichts dieser Korrelation zwischen IL7-Sekretion und Eizellenqualität haben wir diesen Kandidaten aufgenommen, da er im Alterungstranskriptom signifikant verringert ist, obwohl für diese mRNA im RNA-Seq-Datensatz keine Änderungen in der Translation festgestellt wurden.

Reporter wurden durch Fusion des verstärkten YFP-Fluoreszenzproteins mit der 3'-UTR von Tpx2-, Nlrp5-, Golph3-, Il7- oder Thumpd1-mRNAs erzeugt. Nach der In-vitro-Translation wurden diese Konstrukt-mRNAs zusammen mit einer mCherry-mRNA in entblößte Eizellen von jungen und alten Mäusen injiziert und die Translationsrate während der Reifung durch Zeitraffermikroskopie überwacht (Abb. 2a). Als Ladekontrolle verwendet, war das mCherry-Signal für alle Reporter zwischen jungen und alten Eizellen vergleichbar (ergänzende Abbildung 5). Übersetzungsmuster können in drei Hauptkategorien unterteilt werden. Zusätzlich zu einem Muster der konstitutiven Translation unterliegen mRNAs während der Eizellenreifung als Nlrp5 einer verringerten Translation, während für eine andere Gruppe, einschließlich Il7, Thumpd1 und Golph3, eine aktivierte Translation beobachtet wird. Ergänzende Abbildung 6 zeigt zwei gegensätzliche Muster der Ribosomenbeladung während der Reifung und der YFP-Akkumulation in Eizellen, die in GV oder während der In-vitro-Reifung gehalten werden. Die Nlrp5-Translation in jungen Eizellen nahm zunehmend auf ein Plateau ab (ergänzende Abbildungen 6c und 2d), was eine Unterdrückung der Translation widerspiegelt, ein Befund, der mit der Ribosomenbeladung übereinstimmt (ergänzende Abbildungen 1c und 6a). In alten Eizellen war die Translationsrate dieses Reporters jedoch zunächst in beiden Gruppen vergleichbar, erreichte jedoch mit der Zeit kein Plateau wie in jungen Eizellen (Abb. 2d). Dies deutet darauf hin, dass die Translation in alten Eizellen nicht korrekt unterdrückt wird, ein Befund, der mit den Daten aus dem alternden Transkriptom und der Ribosomenbeladung übereinstimmt. Die durch Golph3, Il7 und Thumpd1 3'-UTR verursachte YFP-Akkumulation wurde etwa 3 Stunden nach GVBD aktiviert und nahm danach weiter zu (ergänzende Abbildung 6d und Abbildung 2f, h, j), was wiederum mit der Ribosomenbeladung übereinstimmt (siehe ergänzende Abbildungen 1c und 6b). Allerdings wurde für alle drei 3'-UTRs eine verminderte Anreicherung des Reporters in alten Eizellen festgestellt. Um Unterschiede in der Reporterübersetzung zu quantifizieren, wurde die Akkumulationsrate für jede injizierte Eizelle mithilfe einer Kurvenanpassung42 berechnet. Mit diesem Ansatz ist die Translationsrate von Golph3, Il7 und Thumpd1 in alten Eizellen im Vergleich zu jungen deutlich verringert (Abb. 2g, i, k), während die Translation von Nlrp5 in alten Eizellen deutlich erhöht ist (Abb. 2e). In Tpx2 wurde kein Unterschied in der Übersetzung festgestellt (Abb. 2b, c), was bestätigt, dass es sich bei der veränderten Übersetzung nicht um ein verallgemeinertes Phänomen handelt. Daher steht die erhöhte, verringerte oder unveränderte Akkumulation dieser Reporter im Einklang mit den offensichtlichen Veränderungen im alternden Transkriptom und mit unseren Daten zur Ribosomenbeladung.

ein Schema des YFP-Reportertests. GV-Oozyten von jungen und alten Mäusen wurden 12,5 ng/μl polyadenylierter mCherry und 12,5 ng/μl oligoadenylierter YFP-Reporter, einschließlich Tpx2, Nlrp5, Il7, Thumpd1 und Golph3 3'-UTR, injiziert. Nach der Vorinkubation über Nacht wurden die Eizellen in Cilostamid-freies Medium freigesetzt und YFP- und mCherry-Signale wurden während der Reifung alle 15 Minuten 20 Stunden lang durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet. Die YFP-Signale wurden durch den Pegel der mCherry-Signale normalisiert. b, d, f, h, j Das Verhältnis des YFP/mCherry-Signals für jede Eizelle wurde entsprechend der Inkubationszeit (d) oder mit der auf 0 eingestellten GVBD-Zeit (b, f, h, j) aufgezeichnet. c, e, g, i, k Die Translationsraten wurden für jede Eizelle durch lineare Regression der Reporterdaten zwischen 5 und 10 Stunden (b, j), zwischen 7 und 12 Stunden nach GVBD (f, h) oder zwischen 15 Stunden berechnet und 20 Stunden nach der Inkubationszeit (d). Die Experimente wurden dreimal mit verschiedenen Chargen von Eizellen aus verschiedenen Kohorten alternder Mäuse wiederholt und die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SEM angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant, e ***P = 0,0008, g ****P < 0,0001, h ****P < 0,0001, k ***P = 0,0002. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Basierend auf unserer früheren Erkenntnis, dass die Translation in Eizellen empfindlich auf das Vorhandensein umgebender Kumuluszellen reagiert17, haben wir anschließend getestet, ob sich die Übersetzung unter diesen eher physiologischen Bedingungen in alten Eizellen verändert. Wenn Eizellen noch von Kumuluszellen umgeben sind, ist es schwierig, sie mit der Zeitraffermikroskopie zu überwachen, da sich die Kumuluszellen bewegen, wenn sie sich ausdehnen. Daher verwendeten wir Renilla-Luciferase (RL)-Reporter, die mit der 3'-UTR der Ziel-mRNA fusioniert waren, zusammen mit Firefly-Luciferase (FL) in Eizellen injiziert, während sie noch von Cumuluszellen (COCs) umgeben waren (ergänzende Abbildung 7a). Am Ende der Inkubation wurden die Eizellen entblößt, lysiert und für den Luciferase-Assay verwendet. In allen Fällen wurde die Übersetzung der Reporter von GV auf MII erhöht (ergänzende Abbildung 7b – d). In Übereinstimmung mit den entblößten Oozytendaten war die Translation von Il7 und Thumpd1 in alten MII-Oozyten im Vergleich zu jungen MII-Oozyten erneut signifikant verringert (ergänzende Abbildung 7c, d), wohingegen kein Unterschied in der Tpx2-Translation festgestellt wurde (ergänzende Abbildung 7b). Somit kann die fehlerhafte Translation durch die Aufrechterhaltung der Interaktion zwischen Körper und Keimzellen nicht behoben werden.

In Eizellen hängt die Aktivierung der Translation von der Verlängerung des Poly(A)-Schwanzes einer mRNA ab. Um diese Eigenschaft zu bewerten, verglichen wir den Polyadenylierungszustand der endogenen Tpx2-, Il7- und Thumpd1-mRNAs in jungen und alten Eizellen mithilfe einer Strategie, bei der qPCR-Signale von cDNA verglichen werden, die entweder durch Oligo(-dT) oder Zufallspriming synthetisiert wurden. Dies ist ein weit verbreiteter Test, wenn nur eine begrenzte Anzahl an Zellen verfügbar ist43. Wie in Abb. 3a – c dargestellt, zeigen die drei Transkripte einen offensichtlichen Anstieg von MII gegenüber GV mit Oligo(-dT)-Priming, wohingegen bei zufälligem Priming keine signifikanten Veränderungen beobachtet wurden. Dies steht im Einklang mit der Hypothese, dass die Polyadenylierung der drei Transkripte während der Eizellenreifung zunimmt. Noch wichtiger ist, dass beim Vergleich junger und alter Eizellen die Signale des Oligo(-dT)-Primings sowohl für Il7- als auch für Thumpd1-mRNAs signifikant verringert waren (Abb. 3b, c), wohingegen die Tpx2-Polyadenylierung wiederum unverändert blieb (Abb. 3a). Diese Daten deuten darauf hin, dass die endogene Polyadenylierung in alten Eizellen fehlerhaft ist, ein Befund, der mit der verringerten Translation übereinstimmt, die mit den Reporter-Assays festgestellt wurde. Um die Korrelation Oligo(-dT)/Random-Priming auf zusätzliche mRNAs auszudehnen, haben wir die hinterlegten MII-Daten, die mit Oligo(-dT)-Priming erhalten wurden, und unseren Random-Priming-Datensatz verglichen. Das Verhältnis von Oligo(-dT)/zufälligem Priming ist in jungen und alten MII-Proben für die meisten Gene vergleichbar. Für eine Untergruppe von Transkripten wurden jedoch signifikante Unterschiede im Verhältnis festgestellt. Dazu gehören die Transkripte, die für Il7, Thumpd1, Golph3 und Nlrp5 kodieren. Außerdem wurden Veränderungen für Cpeb1 und Ccnb1 festgestellt (siehe unten), während für Tpx2 und Ccnb2 keine Unterschiede im Verhältnis beobachtet wurden (Abb. 3d). Somit stehen diese veränderten Verhältnisse im Einklang mit einer fehlerhaften mRNA-Polyadenylierung während des Alterns.

a–c-RNA von GV- oder MII-Oozyten von jungen oder alten Mäusen wurde unter Verwendung von zufälligen Hexamer- oder Oligo(-dT)-Primern revers transkribiert, und eine quantitative PCR wurde mit genspezifischen Primern durchgeführt. Die Daten werden durch die durchschnittliche Expression von Dppa3, Rpl19, ActB und Eif4a1 normalisiert, wie unter „Methoden“ beschrieben. an = 3 (GV jung zufällig), 3 (MII jung zufällig), 4 (GV jung oligo(-dT)), 4 (MII jung oligo(-dT)), 2 (GV alt zufällig), 2 (MII alt zufällig ), 3 (GV altes Oligo(-dT)), 3 (MII altes Oligo(-dT)) werden biologisch unabhängige Proben verwendet. bn = 3 (GV jung zufällig), 7 (MII jung zufällig), 4 (GV jung oligo(-dT)), 4 (MII jung oligo(-dT)), 2 (GV alt zufällig), 2 (MII alt zufällig ), 3 (GV altes Oligo(-dT)), 4 (MII altes Oligo(-dT)) werden biologisch unabhängige Proben verwendet. cn = 4 (GV young random), 5 (MII young random), 5 (GV young oligo(-dT)) und 7 (MII young oligo(-dT)), 3 (GV old random), 3 (MII old zufällig), 5 (GV altes Oligo(-dT)), 5 (MII altes Oligo(-dT)) werden biologisch unabhängige Proben verwendet. Die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SD angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige gepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant, *P = 0,029, ***P = 0,0003. d Das Verhältnis der Daten aus Oligo(-dT)24- und zufällig geprimten RNA-Seq-Bibliotheken zwischen jungen und alten Eizellen wird angegeben. Es werden vier biologisch unabhängige Oligo(-dT)-Proben und zwei biologisch unabhängige, zufällig vorbereitete Proben verwendet. Die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SD angezeigt. Für Il7-, Thumpd1-, Ccnb1-, Golph3- und Cpeb1-mRNAs wird ein deutlich verringertes Verhältnis festgestellt. Umgekehrt sind mutmaßliche Veränderungen der Polyadenylierung von Ccnb2- und Tpx2-mRNAs nicht betroffen. Zweiseitige multiple ungepaarte t-Tests wurden verwendet, um die statistische Signifikanz zu bewerten, ns nicht signifikant, **P = 0,0032 für Il7, ***P = 0,000061 für Thumpd1, **P = 0,0025 für Golph3, *P = 0,019 für Cpeb1, *P = 0020 für Ccnb1, ***P = 0,00087 für Nlrp5. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Polyadenylierung von mRNAs und ihre Translation während der Eizellenreifung hängen zu einem großen Teil von der Funktion des RNA-bindenden Proteins (RBP) CPEB120 ab. Dieses RBP interagiert mit cis-wirkenden Elementen, die sich in der 3'-UTR einer mRNA befinden, und baut einen Komplex auf, der die Adenylierung fördert. Mutmaßliche CPEs wurden in Il7-, Thumpd1- und Golph3-mRNAs identifiziert, jedoch nicht in Nlrp5-mRNAs. Darüber hinaus bestätigt RNA-IP mit CPEB1-Antikörpern schlüssig die spezifische CPEB1-Bindung an endogene Il7-, Thumpd1- und Golph3-mRNAs in der Eizelle (ergänzende Abbildung 8). Daher stellten wir die Hypothese auf, dass eine fehlerhafte Funktion von CPEB1 eine Ursache für eine verminderte Polyadenylierung und Translation dieser mRNAs in alternden Eizellen sein könnte. Tatsächlich deuten die RiboTag IP/RNA-Seq-Daten darauf hin, dass die Translationseffizienz (TE)44, definiert als das Verhältnis zwischen Ribosomen-gebundenem und Gesamt-mRNA-Spiegel, für die Cpeb1-mRNA zwar keine statistische Signifikanz erreicht, aber um etwa 50 % verringert ist Eizellen während des mütterlichen Alterns, wohingegen die Gesamt-mRNA-Spiegel zwischen jungen und alten Eizellen vergleichbar sind (Abb. 4a). Um diese Beobachtung zu bestätigen, führten wir RiboTag IP/qPCR mit Eierstockextrakten von jungen und alten Mäusen durch. Da die Cre-Rekombinase in der RiboTag-Maus vom ZP3-Promotor gesteuert wird, prüft die RiboTag-IP des gesamten Ovarextrakts nur die Translation in Eizellen von sekundären zu antralen Follikeln. Unter Verwendung dieses Ansatzes unterschied sich die gesamte Cpeb1-mRNA (Eingabe) nicht zwischen jungen und alten Eierstöcken (Abb. 4b); Allerdings war die Ribosomen-gebundene mRNA in den Eierstöcken alter Mäuse signifikant verringert (Abb. 4c) (P < 0,01). Die verminderte Translation der Cpeb1-mRNA wurde außerdem durch einen Western-Blot von Eizellen junger und alter Mäuse bestätigt. Die CPEB1-Proteinspiegel sind in alten Eizellen im Vergleich zu jungen deutlich um ~50 % verringert (Abb. 4d, e). Bemerkenswert ist, dass in alten Eizellen mit dem alternden Transkriptom ein „offensichtlicher“ und signifikanter Rückgang der CPEB1-Spiegel festgestellt wird (ergänzende Abbildung 1d) sowie ein offensichtlicher Rückgang der Polyadenylierung (Abb. 3d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Abnahme der CPEB1-Proteinexpression in alten Eizellen auf eine verminderte Translation während der wachsenden Follikelstadien sowie während der Reifung zurückzuführen ist.

a MII-Oozyten wurden von jungen und alten RiboTagF/F;Zp3-Cre-Mäusen gesammelt und RiboTag IP gefolgt von RNA-Seq wurde wie unter „Methoden“ beschrieben durchgeführt. Der durchschnittliche CPM für die gesamten Transkripte (Input) und die Ribosomenbeladung der Transkripte (HA) werden angegeben. TE wurde als Verhältnis zwischen Ribosomen-assoziiertem und Gesamt-mRNA-CPM berechnet. Bei dieser Analyse wurden zwei unabhängige biologische Proben verwendet. b, c Eierstöcke wurden von jungen und alten RiboTagF/F;Zp3-Cre-Mäusen gesammelt und RiboTag IP gefolgt von RT-qPCR wurde wie unter „Methoden“ beschrieben durchgeführt. Als Referenzgen wurde Dppa3 verwendet. Eingabedaten (b) und Ribosomen-beladende mRNA (c) werden angegeben. bn = 4 (junge), 6 (alte) biologisch unabhängige Proben werden verwendet. cn = 5 (junge), 7 (alte) biologisch unabhängige Proben werden verwendet. RT-qPCR-Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD dar. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant, **P = 0,0048. d, e CPEB1-Proteinexpression in GV-Oozyten von jungen und alten Mäusen. Als Kontrolle diente die Akkumulation von α-Tubulin. Die Eizellen wurden in Probenpuffer lysiert und für die Western-Blot-Analyse verwendet. Für das Experiment wurden 25 Eizellen pro Spur geladen. Es wird über einen Vertreter von drei Experimenten berichtet. Eine Grafik zeigt die Quantifizierung eines Western Blots auf drei unabhängigen biologischen Replikaten. Die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SD angegeben. Die CPEB1/α-Tubulin-Verhältnisse wurden als fache Veränderungen gegenüber jungen Kontrollpersonen ausgedrückt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, **P = 0,0012. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

CPEB1 ist ein kritisches RBP mit komplexen Funktionen während der Eizellenentwicklung. Aufgrund seiner Rolle bei der Regulierung der Translation kritischer Zellzyklusregulatoren, einschließlich Cykline, gilt es auch als wichtiger Regulator des Fortschreitens durch den meiotischen Zellzyklus. Wenn das Altern mit einer Funktionsstörung von CPEB1 verbunden wäre, wäre ein verändertes Translationsmuster des prototypischen CPEB1-Ziels Ccnb1 zu erwarten. Diese Möglichkeit wurde durch Injektion eines Reporters, der durch die 3'-UTR von Ccnb1 gesteuert wird, in Eizellen von jungen und alten Mäusen und die Untersuchung seiner Translationsrate im GV-Stadium verifiziert. In ausgewachsenen GV-Oozyten fungiert CPEB1 als Repressor der Translation. Tatsächlich fanden wir heraus, dass die Translationsrate des Ccnb1-Reporters in GV-Oozyten von alten Mäusen im Vergleich zu denen von jungen Mäusen erhöht ist (Abb. 5a, b). Als Negativkontrolle verwendeten wir die Translation eines anderen Cyclins, Ccnb2, von dem wir gezeigt haben, dass es in GV-Oozyten nicht durch CPEB1 unterdrückt wird15,45. Es wurden keine Unterschiede im Ccnb2-Reportersignal zwischen jungen und alten GV-Oozyten beobachtet (Abb. 5c, d). Angesichts der Tatsache, dass CCNB1 als regulatorische Untereinheit von CDK1 fungiert, dem Hauptregulator des Fortschreitens der Meiose, haben wir getestet, ob eine mit dem Altern verbundene Funktionsstörung von CPEB1 Auswirkungen auf den Zeitpunkt des Fortschreitens des meiotischen Zellzyklus haben würde. Wir inkubierten Eizellen in einem Reifungsmedium und zeichneten alle 15 Minuten den Zeitpunkt der GVBD mittels Zeitraffermikroskopie auf. Unter diesen Bedingungen wird der Wiedereintritt in die Meiose in alten Eizellen um etwa 15 Minuten deutlich beschleunigt (Abb. 6a). Um eine vorzeitige Aktivierung von CDK1 zu verifizieren, wurden Eizellenextrakte mit einem CDK1-Substratprotein-Phosphatase-1-Peptid (GST-PP1) inkubiert und die Phosphorylierung wurde mit phosphospezifischen Antikörpern (pT320-PP1) gemessen46,47,48. In Anbetracht der Tatsache, dass der maximale Unterschied in der GVBD-Zeit zwischen jungen und alten Eizellen 60 Minuten nach der Inkubation beträgt (Abb. 6a) und die CDK1-Aktivierung vor GVBD erfolgt, untersuchten wir die CDK1-Aktivität in jungen und alten Eizellen nach 45 Minuten Entfernung des PDE-Inhibitors. Die CDK1-Aktivität war in alten Eizellen im Vergleich zu jungen Eizellen signifikant erhöht (Abb. 6c, d). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein Verlust der translationalen Repression durch CPEB1 während der Prophase I zu einer erhöhten Akkumulation von CCNB1 führt und somit die Schwellenwerte der CDK1-Aktivität sowie den Zeitpunkt des meiotischen Wiedereintritts beeinflusst.

a–d, g–j GV-Oozyten von jungen und alten Mäusen (a–d) oder Cpeb1+/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/+-Oozyten) und Cpeb1fl/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/−-Oozyten) (g–j) wurden mit polyadenyliertem mCherry und YFP-Ccnb1 3'-UTR (a, b, g, h) oder YFP-Ccnb2 3-'UTR (c, d, i, j) injiziert. Nach 3 Stunden Vorinkubation wurden die Eizellen mit Cilostamid-Behandlung im GV-Stadium gehalten. YFP- und mCherry-Signale wurden 15 Stunden lang alle 15 Minuten durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet. Die YFP-Signale wurden durch den Pegel der mCherry-Signale normalisiert. a, c, g, i Das YFP/mCherry-Signal in jeder Eizelle wurde in Abhängigkeit von der Inkubationszeit aufgezeichnet. b, d, h, j Die Translationsrate wurde für jede Eizelle durch lineare Regression der Reporterdaten zwischen 3 und 13 Stunden berechnet. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SEM angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant, ****P < 0,0001. e, f CPEB1-Proteinexpression in CPEB1+/+ GV-Oozyten und CPEB1+/− GV-Oozyten. Als Kontrolle diente die Akkumulation von α-Tubulin. Die Eizellen wurden in Probenpuffer lysiert und für die Western-Blot-Analyse verwendet, wobei 30 Eizellen pro Spur für das Experiment geladen wurden. e Es wird ein Vertreter von vier Experimenten berichtet. f Eine Grafik zeigt die Quantifizierung von vier unabhängigen Western-Blot-Analysen. Der Balken stellt den Mittelwert \(\pm\) SD dar. CPEB1/α-Tubulin-Verhältnisse wurden als fache Veränderungen über CPEB1+/+-Oozyten ausgedrückt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, **P = 0,0023. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

a, b GV-Oozyten von jungen und alten Mäusen (a) oder GV-Oozyten von Cpeb1+/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/+-Oozyten) und Cpeb1fl/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/−-Oozyten) (b) wurden mit Cilostamid inkubiert Alle 15 Minuten wurden freie Mittel- und Hellfeldbilder aufgenommen. Die kumulierten GVBD-Zeiten wurden aufgezeichnet. Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt und die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SD angezeigt. Zweiseitige, mehrfache, ungepaarte Student-t-Tests wurden verwendet, um die statistische Signifikanz zu jedem Zeitpunkt zu bewerten. a P = 0,00032 für 30 Minuten, P = 0,0076 für 45 Minuten, P = 0,016 für 60 Minuten. b P = 0,0036 für 45 Minuten, P = 0,0051 für 60 Minuten, P = 0,019 für 75 Minuten. Die c-f-CDK1-Aktivität wurde mithilfe von Kinase-Assays gemessen. Junge und alte GV-Oozyten (c, d) oder CPEB1+/+ und CPEB1+/− GV-Oozyten (e, f) wurden 45 Minuten lang mit Cilostamid-freiem Medium inkubiert. Nachdem die Eizellen durch Einfrieren und Auftauen lysiert worden waren, wurden die Eizellen 30 Minuten lang mit dem GST-PP1-Fragment als Substrat inkubiert. Die Eizellen wurden in einem Probenpuffer lysiert und für die Western-Blot-Analyse verwendet. Die Phosphorylierung von T320 PP1 wurde durch einen phosphospezifischen Antikörper (pT320-PP1) nachgewiesen. Der Grad der Gesamtsubstratbeladung wurde durch Ponceau S-Färbung (Gesamt-PP1) bewertet. Für das Experiment wurden zehn Eizellen pro Spur geladen. c, e Ein Vertreter der Experimente wird berichtet. d, f Ein Diagramm zeigt die Quantifizierung von zwei oder drei unabhängigen Western-Blot-Analysen. Die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SD angezeigt. pT320-PP1/Gesamt-PP1-Verhältnisse wurden als fache Veränderungen gegenüber jungen Kontrollen ausgedrückt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, d *P = 0,025, f *P = 0,033. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu testen, ob die Haploinsuffizienz von CPEB1 die mit der Eizellenalterung verbundenen Phänotypen rekapituliert, verwendeten wir bedingte heterozygote CPEB1-Mäuse (Cpeb1fl/+; Zp3-Cre). Beim Western-Blot wurde eine 50-prozentige Abnahme des CPEB1-Proteins in jungen CPEB1+/–-Eizellen im GV-Zustand festgestellt (Abb. 5e, f). Diese Abnahme der CPEB1-Expression ist vergleichbar mit der bei alten Mäusen beobachteten (Abb. 4d, e). Um zu untersuchen, ob dieser teilweise Verlust von CPEB1 in jungen Eizellen die mit dem Altern verbundenen Phänotypen widerspiegelt, untersuchten wir die Translationsrate von Ccnb1, die GVBD-Zeit und die CDK1-Aktivität in diesem Ruhezustand. Diese Messungen in CPEB1+/−-Oozyten zeigen, dass die Translationsrate des Ccnb1-Reporters in GV-Oozyten erhöht ist (Abb. 5g, h), wohingegen beim Ccnb2-Reporter keine Unterschiede beobachtet wurden (Abb. 5i, j). Eine beschleunigte GVBD-Zeit und eine erhöhte CDK1-Aktivität wurden auch in CPEB1 +/– Eizellen beobachtet (Abb. 6b, e, f). Obwohl die Unterschiede nicht groß sind, wurde beim Vergleich von heterozygotem und homozygotem Null für den Cpeb1-Locus ein deutlicher, von der Gendosis abhängiger Effekt beobachtet (ergänzende Abbildung 9a). Somit rekapituliert die genetische Manipulation der CPEB1-Spiegel in jungen Eizellen alle Phänotypen, die wir in alten Eizellen beschrieben haben.

Wenn die Unterdrückung der Ccnb1-Translation in GV-Oozyten ausschließlich auf die verringerten Cpeb1-Spiegel in alten Eizellen zurückzuführen wäre, sollte eine Erhöhung der Akkumulation von CPEB1-Protein diesen Translationsphänotyp retten. Um diese Möglichkeit zu testen, wurde GV-Oozyten zusammen mit dem Ccnb1-Reporter in vitro translatierte Cpeb1-mRNA injiziert und die Anreicherung von YFP gemessen. Kontrollexperimente, bei denen die CPEB1-Proteinspiegel mittels Western Blot gemessen wurden, zeigten einen bis zu zweifachen Anstieg der CPEB1-Proteinspiegel im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 7a, b). Unter diesen Bedingungen wurde der Anstieg der Akkumulation des Ccnb1-Reporters in alten Eizellen durch Co-Injektion mit der Cpeb1-mRNA umgekehrt. Die Translationsrate in diesen koinjizierten Eizellen war identisch mit der junger Kontrollen und nahm im Vergleich zu alten Kontrollen signifikant ab (Abb. 7c). Eine ähnliche Rettung der De-Repression wurde beobachtet, als jungen heterozygoten CPEB1-Oozyten Reporter- und Cpeb1-mRNA injiziert wurden (Abb. 7d).

a, b CPEB1-Proteinexpression in GV-Oozyten, denen Cpeb1-mRNA in verschiedenen Konzentrationen injiziert wurde. Als Kontrolle diente die Akkumulation des endogenen α-Tubulins. Die Eizellen wurden in einem Probenpuffer lysiert und für die Western-Blot-Analyse verwendet. Insgesamt wurden für das Experiment 30 Eizellen pro Spur geladen. b Ein Diagramm zeigt die Quantifizierung einer einzelnen Western-Blot-Analyse. Die CPEB1/α-Tubulin-Verhältnisse wurden als fache Änderungen gegenüber der Kontrolle ausgedrückt. c–f GV-Oozyten von jungen und alten Mäusen oder Cpeb1+/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/+-Oozyten) und Cpeb1fl/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/–-Oozyten) wurden polyadenyliertes mCherry, YFP-Ccnb1 3'-UTR, injiziert und Cpeb1-mRNA (100 ng/μl). Nach der Vorinkubation über Nacht wurden die Eizellen mit Cilostamid-Behandlung im GV-Stadium gehalten (c, d) oder zur Reifung in das Cilostamid-freie Medium freigesetzt (e, f). YFP- und mCherry-Signale wurden 20 Stunden lang alle 15 Minuten durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet. Die YFP-Signale wurden durch den Pegel der mCherry-Signale normalisiert. Die Translationsrate wurde für jede Eizelle durch lineare Regression der Reporterdaten berechnet. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SEM angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet, ns nicht signifikant, c **P = 0,0076, ***P = 0,0002, d *P = 0,034, **P = 0,0015, e *P = 0,025, *** P = 0,0001, f **P = 0,0048, ****P < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Beim Wiedereintritt in die Meiose wechselt CPEB1 seine Funktion vom Repressor zum Aktivator der Translation. Wir haben getestet, ob die Translation von Ccnb1 während der Reifung auch durch das Altern der Mutter beeinflusst wird, wie wir für Il7, Thumpd1 und Golph3 gezeigt haben (Abb. 2f – k). Die Translationsrate des Ccnb1-Reporters war in alten Eizellen während der Reifung signifikant verringert (Abb. 8a, e), wohingegen bei Ccnb2 keine Unterschiede beobachtet wurden (Abb. 8b, f). Eine verminderte Translation des Ccnb1-Reporters wurde auch in jungen Eizellen mit CPEB1-Haploinsuffizienz festgestellt, ohne dass sich die Ccnb2-Reporter-Translation während der Eizellenreifung signifikant veränderte (Abb. 8c, d, g, h). Sowohl in alten Eizellen als auch in Eizellen mit Haploinsuffizienz rettete die Überexpression von Cpeb1 die verringerte Übersetzung des Ccnb1-Reporters (Abb. 7e, f). Auch hier gab es einen Cpeb1-Gen-Dosierungseffekt von CPEB1 auf die Translation des Ccnb1-Reporters (ergänzende Abbildung 9b). Auch die Translation der Reporter Il7, Thumpd1 und Golph3 war in CPEB1+/- Eizellen während der Reifung signifikant verringert (Abb. 9b – d, f – h), während die Translation von Tpx2 unverändert blieb (Abb. 9a, e). Alle diese Ergebnisse stimmen vollständig mit dem Ergebnis von RNA-IP mit CPEB1-Antikörpern überein (ergänzende Abbildung 8). Daher wirkt sich eine Funktionsstörung von CPEB1 während des mütterlichen Alterns auch auf die Translation während der Reifung aus.

GV-Oozyten von jungen und alten Mäusen (a, b, e, f) oder GV-Oozyten von Cpeb1+/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/+-Oozyten) und Cpeb1fl/+;Zp3Cre (CPEB1+/−-Oozyten) (c, d, g, h) wurden 12,5 ng/µl polyadenyliertes mCherry und 12,5 ng/µl YFP-Ccnb1 3'-UTR (a, c, e, g) oder YFP-Ccnb2 3'-UTR (b, d, f, h) injiziert ). Nach der Vorinkubation über Nacht wurden die Eizellen zur Reifung in das Cilostamid-freie Medium freigesetzt. YFP- und mCherry-Signale wurden 20 Stunden lang alle 15 Minuten durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet. Die YFP-Signale wurden durch den Pegel der mCherry-Signale normalisiert. Das a–d-YFP/mCherry-Signal in jeder Eizelle wurde in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der GVBD aufgezeichnet. Die e–h-Translationsrate wurde für jede Eizelle durch lineare Regression der Reporterdaten zwischen 5 und 10 Stunden (a, c) oder zwischen 3 und 7 Stunden (b, d) berechnet. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SEM angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant, ****P < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

GV-Oozyten von Cpeb1+/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/+-Oozyten) und Cpeb1fl/+;Zp3Cre-Mäusen (CPEB1+/–-Oozyten) wurden polyadenyliertes mCherry und YFP-Tpx2 3'-UTR (a, e), YFP-Il7 injiziert 3'-UTR (b, f), YFP-Thumpd1 3'-UTR (c, g) oder YFP-Golph3 3'-UTR (d, h). Nach der Vorinkubation über Nacht wurden die Eizellen zur Reifung in das Cilostamid-freie Medium freigesetzt. YFP- und mCherry-Signale wurden 20 Stunden lang alle 15 Minuten durch Zeitraffermikroskopie aufgezeichnet. Die YFP-Signale wurden durch den Pegel der mCherry-Signale normalisiert. Das a–d-YFP/mCherry-Signal in jeder Eizelle wurde in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der GVBD aufgezeichnet. Die e–h-Translationsrate wurde für jede Eizelle durch lineare Regression der Reporterdaten zwischen 5 und 10 Stunden (a, d) oder zwischen 7 und 12 Stunden nach GVBD (b, c) berechnet. Die Experimente wurden dreimal wiederholt und die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SEM angezeigt. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant, *P = 0,017, **P = 0,0070, ****P < 0,0001. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Wir haben zuvor gezeigt, dass eine verminderte Ccnb1-Translation zu einer erhöhten Aneuploidierate und Unfruchtbarkeit führt46. Angesichts der Tatsache, dass eine Änderung des Zeitpunkts des Wiedereintritts in die Meiose und eine verringerte Translation von Ccnb1 in Eizellen zu Unfruchtbarkeit führen, haben wir getestet, ob ein teilweiser Verlust der CPEB1-Expression in Eizellen die Fruchtbarkeit beeinträchtigen kann, indem wir weibliche CPEB1+/–-Mäuse mit männlichen Wildtyp-Mäusen gepaart haben. Bedingter CPEB1-Knockout nach der Geburt führt bei weiblichen Mäusen zu völliger Unfruchtbarkeit15,49. Obwohl es keinen Unterschied in der Anzahl der entnommenen Eizellen (Abb. 10a), der Reifungsrate und dem Durchmesser der Eizellen zwischen CPEB1+/+- und CPEB1+/−-Mäusen gab (ergänzende Abbildung 10a – c), war die Fruchtbarkeit 3 ​​Monate nach der Paarung signifikant verringert (Abb. 10b) und CPEB1+/–-Mäuse brachten im Vergleich zu CPEB1+/+-Mäusen (Abb. 10c) zunehmend deutlich weniger Junge hervor. Bei CPEB1+/− Mäusen ist auch die Zahl der Schwangerschaften zurückgegangen (Abb. 10d). Das Alter der ersten Trächtigkeit von CPEB1+/+- und CPEB1+/−-Mäusen und das Körpergewicht der Jungtiere waren vergleichbar (ergänzende Abb. 10d, e). Somit führt eine Cpeb1-Haploinsuffizienz bei jungen Mäusen zu einer Verschlechterung der Eizellenqualität und rekapituliert einige der Phänotypen, die mit einer CPEB1-Dysfunktion beim mütterlichen Altern verbunden sind.

a Cpeb1+/+;Zp3Cre-Mäuse (CPEB+/+-Mäuse) und Cpeb1fl/+;Zp3Cre-Mäuse (CPEB+/−-Mäuse) wurden mit PMSG geprimt und die Eierstöcke wurden 44 Stunden später präpariert. Die GV-Oozyten aus jedem Eierstockpaar wurden gezählt. Die Daten werden als Box- und Whisker-Plots dargestellt. Die Mittellinie gibt den Medianwert an, während sich das Kästchen auf das 25. bis 75. Perzentil bezieht und Whiskers Minimal- und Maximalwerte markieren. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ns nicht signifikant. b–d weibliche CPEB1+/+ und CPEB1+/− Mäuse wurden mit männlichen WT-Mäusen gepaart. Die Zucht wurde begonnen, als die Mäuse mindestens 8 Wochen alt waren. b Die kumulierte Anzahl an Jungen pro Weibchen, die von CPEB1+/+- und CPEB1+/−-Mäusen stammten, wurde aufgezeichnet. Die Daten werden als Mittelwert \(\pm\) SD angegeben. Zweiseitige, mehrfache, ungepaarte Student-t-Tests wurden verwendet, um die statistische Signifikanz zu jedem Zeitpunkt zu bewerten. *P = 0,027 für 3 Monate, *P = 0,030 für 4 Monate, *P = 0,0052 für 5 Monate, ***P = 0,00011 für 6 Monate. c Die Anzahl der Welpen pro Wurf bis zu drei Trächtigkeiten wurde aufgezeichnet und die Daten als Box- und Whisker-Plots gemeldet. Die Mittellinie gibt den Medianwert an, während sich das Kästchen auf das 25. bis 75. Perzentil bezieht und Whiskers Minimal- und Maximalwerte markieren. Die Anzahl der analysierten Würfe ist in Klammern angegeben. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, *P = 0,030. d Die Geburtshäufigkeit wurde gemessen und als Anzahl der Würfe pro Monat und Weibchen ausgedrückt. Die Daten werden als Box- und Whisker-Plots dargestellt. Die Mittellinie gibt den Medianwert an, während das Kästchen das 25. bis 75. Perzentil enthält und Whiskers die Minimal- und Maximalwerte markieren. Zur Bewertung der statistischen Signifikanz wurden zweiseitige, ungepaarte Student-t-Tests verwendet, ***P = 0,0008. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Mithilfe verschiedener komplementärer Ansätze haben wir festgestellt, dass das Altern der Mutter mit einer Störung des mRNA-Translationsprogramms verbunden ist, das während der Eizellenreifung ausgeführt wird. Ungefähr 5 % der in der Eizelle vorhandenen mRNAs werden während der Reifung falsch übersetzt. Obwohl die Veränderungen in der Translation nicht tiefgreifend sind, schlagen wir vor, dass die kumulativen Auswirkungen einer ineffizienten Translation und der daraus resultierenden veränderten Proteostase einen Einfluss auf die Eizellenqualität haben. Mechanistisch dokumentieren wir, dass die Translation der mRNA, die für ein RBP kodiert, das für die Translationsregulation in der Eizelle entscheidend ist, CPEB1, beeinträchtigt wird, was zu einer verminderten Akkumulation dieses Proteins führt. Dies wiederum führt zu einer veränderten Translation in Eizellen und einem fehlerhaften Verlauf durch den meiotischen Zellzyklus. Die Assoziation von CPEB1 mit diesen in alten Eizellen nachgewiesenen Phänotypen wird durch ein Modell der Haploinsuffizienz von CPEB1 zusammengefasst, bei dem ähnliche Verringerungen des CPEB1-Proteins in jungen Eizellen induziert werden. Darüber hinaus rettet eine Erhöhung der CPEB1-Spiegel in alten Eizellen diese Translationsphänotypen. Daher glauben wir, dass eine veränderte CPEB1-Funktion, die wahrscheinlich während des Eizellenwachstums auftritt, der molekulare Defekt ist, der einigen Phänotypen zugrunde liegt, die mit einer verminderten Eizellenfitness während des mütterlichen Alterns verbunden sind. Zusammen mit der verminderten Produktion von Eizellen aufgrund der Follikeldepletion kann die veränderte CPEB1-abhängige Störung der De-novo-Proteinsynthese die mit zunehmendem Alter beobachtete verminderte Fruchtbarkeit widerspiegeln.

Unsere RiboTag IP/RNA-Seq-Daten zeigen eine Veränderung der Ribosomenbeladung in alten Eizellen im Vergleich zu jungen Eizellen. Obwohl die Aussagekraft dieser Analyse durch die Verfügbarkeit alter Eizellen für die molekulare Analyse begrenzt war, sind unsere Daten intern konsistent. Beispielsweise korreliert der TE in jungen Kontroll-Oozyten dieser Studie stark mit dem, der in anderen von uns erstellten Datensätzen gemessen wurde14,15, sowie mit den von anderen gemeldeten RNA-Seq-Daten zur Translation50. Vergleich zwischen unseren Daten und dem Translatom von Pan et al24. zeigt konsistente Auswirkungen auf einige Gene. Darüber hinaus sagt die GO-Analyse eine höchst signifikante Störung der Translation von Komponenten voraus, die für die Biogenese/Funktion der Mitochondrien notwendig sind. Eine fehlerhafte Mitochondrienfunktion ist ein Kennzeichen des Alterns37, und es wurde über eine veränderte Translation mitochondrialer Proteine ​​berichtet. Die Vorhersage einer veränderten Ribosomen-assoziierten Proteinacetylierung und Ribosomenbiogenese wird auch durch unseren Befund einer veränderten Polyadenylierung der Thumpd1-mRNA und einer veränderten Translation eines Reporters, der durch die 3'-UTR von Thumpd1 gesteuert wird, gestützt. Ein Vergleich unserer Daten mit den kürzlich von anderen27 gemeldeten Daten zeigt jedoch leider nur geringe oder keine Überschneidungen, mit der möglichen Ausnahme einer Verringerung der Sgk1-Übersetzung. Obwohl dieser Bericht eine veränderte Translation von 38 mRNAs dokumentierte (FDR < 0,1; 8 mRNAs mit FDR < 0,05), entdecken wir weiter verbreitete Defekte, die sich auf 726 mRNAs belaufen, wenn derselbe Cutoff angewendet wird (FDR < 0,1, 256 mRNAs mit FDR < 0,05). . Der Grund für diese Diskrepanz ist derzeit nicht klar. Es ist zu beachten, dass Del Llano et al.27 die Translation unmittelbar nach der In-vitro-GVBD beurteilten, einem Zeitraum, in dem sich die Aktivierung/Unterdrückung der Translation minimal von der in ruhenden Eizellen unterscheidet15. Umgekehrt untersuchten wir Veränderungen in der Translation in MII-Oozyten, die in vivo gereift waren, wenn die Unterschiede in der Translation ein Maximum erreicht hatten.

Insgesamt deuten unsere Daten auf eine fehlerhafte Funktion von CPEB1 als eine der molekularen Ursachen der veränderten Translation hin. Diese Schlussfolgerung basiert auf (1) einer veränderten Translation der Cpeb1-mRNA in Eizellen und einer damit verbundenen 50-prozentigen Abnahme des CPEB1-Proteins; (2) Defekte Übersetzung von Ccnb1-, Il7 Thumpd1- und Golph3-mRNAs, die allesamt echte CPEB1-Ziele sind; (3) Veränderte Polyadenylierung von Ccnb1, Il7 Thumpd1 und Golph3; (4) Veränderte Parameter des Wiedereintritts der Eizelle in den Zellzyklus, vorhergesagt durch veränderte Regulierung der CCNB1-Synthese; (5) Eine fehlerhafte Akkumulation von CPEB1 in jungen Eizellen rekapituliert die in alten Eizellen beobachtete Translation und meiotische Progression vollständig, und eine Erhöhung des CPEB1-Proteinspiegels in alten Eizellen rettet die Translationsphänotypen. Daher basieren unsere Schlussfolgerungen auf mehreren unabhängigen Beobachtungen, die alle auf eine CPEB1-Dysfunktion während des Alterns hinweisen. Es sollte beachtet werden, dass, obwohl dies von einigen nicht erkannt wurde51, andere berichtet haben, dass das mütterliche Altern zu einem beschleunigten Wiedereintritt in den meiotischen Zellzyklus führt52,53, wie wir hier ausführlich beschrieben haben. Darüber hinaus beobachten wir, obwohl die festgestellten Auswirkungen im Zusammenhang mit der Cpeb1-Haploinsuffizienz nicht schwerwiegend sind, durchgängig einen dosisabhängigen Effekt des Cpeb1-Gens, was die Gültigkeit unserer Beobachtungen untermauert.

Eine bioinformatische Analyse der Eigenschaften der Transkripte, die während des Alterns beeinflusst werden, zeigt, dass nicht alle assoziierten 3'-UTRs ein mutmaßliches CPE enthalten. Von den 126 analysierten 3'-UTRs können wir in 84 ein mutmaßliches CPE identifizieren, während dieses cis-wirkende Element in 42 3'-UTRs nicht nachgewiesen wird. Dies wird durch die Analyse der Nlrp5-mRNA dokumentiert. Die Translation der endogenen Nlrp5-mRNA ist in unserem Datensatz erhöht, und im hinterlegten Alterungstranskriptom wird ein offensichtlicher Transkriptanstieg festgestellt. Darüber hinaus zeigen Reporterdaten eine fehlerhafte Unterdrückung der Nlrp5-Übersetzung. Das Nlrp5 3'-UTR enthält keine erkennbaren CPE-Elemente und das endogene Nlrp5 wird in einem RIP-Assay nicht immunpräzipitiert; Daher können andere Mechanismen als die CPEB1-vermittelte Translation verändert werden. Dass nicht alle betroffenen Transkripte ein CPE enthalten, lässt sich auch aus der Analyse der mRNAs schließen, die für die mitochondrialen ribosomalen Proteine ​​kodieren. Diese Ergebnisse legen nahe, dass entweder die Translation einiger mRNAs indirekt durch ein dysfunktionales CPEB1 beeinflusst wird oder dass komplexere Ereignisse die Translation mütterlicher mRNAs während des Alterns stören. In diesem letzteren Szenario wirkt eine CPEB1-abhängige Komponente parallel zu einer Änderung anderer Regulierungskreise, die die Übersetzung steuern. Die beteiligten RBPs sowie die genauen molekularen Mechanismen bedürfen weiterer Untersuchungen.

Angesichts der erhöhten Translation in GV-Oozyten, gefolgt von einer verringerten Translationsrate während der Reifung, berechnen wir, dass die Gesamtaktivierung der Ccnb1-mRNA-Translation in alten Eizellen um 50 % verringert ist. Dieser Rückgang ist erheblich und stört wahrscheinlich den meiotischen Fortschritt. Beispielsweise stellen wir fest, dass eine 30-prozentige Abnahme der Ccnb1-mRNA-Translation beim Ccnb2-Funktionsverlust mit einem signifikanten Anstieg der Aneuploidie verbunden ist46. Die Bindung zwischen Kinetochor und Mikrotubuli wird durch die CDK1-Aktivität reguliert und eine Änderung der CDK1-Aktivität führt zu einer Verzögerung der Chromosomen in der Anaphase I54. Darüber hinaus wurde in Studien berichtet, dass die pharmakologische Beschleunigung der Meiose I zu einer höheren Aneuploidie-Rate führt55,56. Daher könnten eine Änderung des Zeitpunkts des Wiedereintritts in die Meiose und eine veränderte CDK1-Aktivierung mit der bei gealterten Eizellen beschriebenen Aneuploidie zusammenhängen.

Die posttranskriptionelle Regulation, die die Cpeb1-mRNA-Translation steuert, wurde nicht umfassend untersucht. CPEB1 bindet jedoch an seine eigene mRNA (ergänzende Abbildung 8) und unterdrückt seine eigene Translation in GV-Oozyten57. Darüber hinaus wurde ein Element beschrieben, das den AU-reichen Bindungsfaktor 1 (AUF1) bindet, und eine Funktion zur microRNA-abhängigen Modulation von Cpeb1 wurde in Neuroblastomzellen beschrieben58. Daher könnten mehrere mögliche Mechanismen zu einer verminderten Translation von Cpeb1 während des Wachstums und der Reifung der Eizelle führen, Mechanismen, die weiterer Untersuchung bedürfen.

Insgesamt stützen unsere Daten nachdrücklich das Konzept, dass eine Störung des Translationsprogramms in Eizellen von Mäusen mit dem Altern der Mutter zusammenhängt. Darüber hinaus liefern wir Hinweise darauf, dass eine veränderte Stöchiometrie des CPEB1-Proteins einer der molekularen Defekte sein könnte, die eine veränderte mütterliche mRNA-Translation in alternden Eizellen verursachen. Die Tatsache, dass diese Phänotypen durch Überexpression von CPEB1 gerettet und durch ein Modell der Cpeb1-Haploinsuffizienz in Eizellen junger Frauen rekapituliert werden können, stimmt nicht nur mit anderen Beobachtungen überein, sondern liefert auch eine überzeugende Unterstützung für unsere Gesamthypothese. Es sollte auch beachtet werden, dass heterozygote Deletionen des Cpeb1-Gens beim Menschen mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz in Verbindung gebracht wurden59,60,61,62, eine Ansicht, die die Cpeb1-abhängigen Phänotypen während des Alterns weiter stützt. Ein gestörter CPEB1-abhängiger Übersetzungsmodus ist möglicherweise nicht der einzige Mechanismus, da vorläufige Erkenntnisse auch auf eine Störung einer CPEB1-unabhängigen Übersetzungskomponente hinweisen. Weitere Studien sind erforderlich, um festzustellen, wie all diese Fehler im Übersetzungsprogramm kumulativ zusammenwirken und die Qualität und Fruchtbarkeit der Eizellen beeinträchtigen.

Es sollte darauf hingewiesen werden, dass eine veränderte Übersetzung nur eine der Komponenten ist, die mit dem reproduktiven Altern verbunden sind. Obwohl nicht tiefgreifend, ist die verminderte Qualität und Fruchtbarkeit der Eizellen bei jungen Mäusen mit der Cpeb1-Haploinsuffizienz vor dem Hintergrund einer normalen Anzahl ovulierter Eizellen verbunden, was wahrscheinlich mit der starken Abnahme der Anzahl reifender Follikel und der Anzahl ovulierter Eizellen während des Alterns zusammenhängt. Daher schlagen wir vor, dass der insgesamt beobachtete Rückgang der Fruchtbarkeit während des Alterns die Summe oder die zusammengesetzten Auswirkungen der veränderten Anzahl produzierter Eizellen und ihrer fehlerhaften Entwicklungskompetenz aufgrund einer veränderten mütterlichen mRNA-Translation ist.

Alle experimentellen Verfahren mit Tiermodellen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California in San Francisco (AN182026-03A) genehmigt. Alle verwendeten Tiere stammten vom Inzuchtstamm C57BL/6. Die Mäuse wurden in einem 12-stündigen Licht-/12-stündigen Dunkelzyklus bei einer Temperatur von 18–23 °C und einer Luftfeuchtigkeit von 40–60 % gehalten. Bei den verwendeten jungen Mäusen handelte es sich um 1 Monat alte Weibchen, wohingegen 12–15 Monate alte weibliche Züchter im Ruhestand als alte Mäuse galten. C57BL/6-Zp3CreRpl22tm1.1Psam (RiboTagF/F;Zp3-Cre) Mäuse wurden von Jackson Laboratories erhalten und wie zuvor beschrieben gezüchtet29. Auf CPEB1 ausgerichtete Mäuse waren ein Geschenk von Referenz. In unserer Einrichtung wurden weibliche Mäuse vom Typ 63 und C57BL/6-Cpeb1F/+;Zp3-Cre gezüchtet.

Weiblichen Mäusen wurden 5 IE Serumgonadotropin (PMSG; MyBioSource) von trächtigen Stuten injiziert, um das Follikelwachstum zu induzieren, und sie wurden 44 Stunden nach der Injektion getötet. Die Eierstöcke wurden präpariert und COCs wurden in Medien gesammelt, die HEPES-modifiziertes minimales essentielles Medium Eagle (Sigma-Aldrich, M2645), ergänzt mit 0,23 mM Natriumpyruvat (Gibco, 11360070), Penicillin-Streptomycin (Genesee Scientific Corporation (GenClone), 25, enthielten -512) und 3 mg/ml BSA (Sigma-Aldrich, SIAL-A3311), 6 mM Natriumbicarbonat (JT-Baker, 3506-1) und ein PDE-Hemmer (1 µM Cilostamid (Calbiochem, 231085) oder 2 µM Milrinon (Enzo ALK-270-083)). Das Absaugen durch eine Glaspipette ermöglichte die Entfernung der umgebenden Kumuluszellen. Entblößte Eizellen wurden im GV-Stadium in α-MEM (Gibco, 12561-056), ergänzt mit 0,23 mM Natriumpyruvat, Penicillin-Streptomycin und 1 µM Cilostamid (oder 2 µM Milrinon), bei 37 °C und 5 % CO2 gehalten. Zur Sammlung von In-vivo-MII-Oozyten wurden weiblichen Mäusen 48 Stunden nach der PMSG-Injektion 5 IE PMSG und anschließend 10 IE menschliches Choriongonadotropin (hCG; Goldline Labs) injiziert und nach 13 Stunden für die Entnahme ovulierter Eizellen aus dem Eileiter getötet Röhren.

Für die RiboTag-Immunpräzipitation wurden Eizellen von weiblichen RiboTagF/F;Zp3-Cre-Mäusen, die mit 5 IU PMSG und anschließend 10 IU hCG stimuliert wurden, oder Eierstöcke von weiblichen RiboTagF/F;Zp3-Cre-Mäusen, die nur mit 5 IU PMSG stimuliert wurden, verwendet. Eizellen wurden in 10 µl 1× PBS (Invitrogen, AM9625), ergänzt mit 0,1 % w/v Polyvinylpyrrolidon (PVP; Sigma, P0930), 0,1 % v/v Cyclohexamid (CHX; Sigma C7698) und 250 U RNAseOUT ( Invitrogen 10777-019), dann in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei −80 °C gelagert. Die Eierstöcke wurden im Ganzen entnommen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert. Um Proben für das IP vorzubereiten, wurde das entsprechende Volumen (80 µl pro Probe) Dynabeads™ Protein G (Invitrogen, 10004D) zweimal in 250 µl Homogenisierungspuffer (HB: 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM KCl, 12 mM MgCl2 und 1 % v/v NP-40) auf einem Rotor bei 4 °C für 5 Minuten pro Waschgang. Zwei zusätzliche Waschgänge wurden mit 250 µl ergänztem HB (sHB: HB ergänzt mit 1 mM DTT (Sigma 646563), 1× HALT-Proteaseinhibitor (Fisher P178441), 200 Einheiten/ml RNaseOUT, 200 Einheiten/ml RNasin (Promega N2115) durchgeführt. 100 µg/ml CHX) auf einem Rotor bei 4 °C für 5 Minuten pro Waschgang. Nach der letzten Wäsche wurden die Perlen mit sHB ​​wieder auf das ursprüngliche Volumen eluiert. Eizellenproben wurden aufgetaut und gepoolt, um insgesamt 200 Eizellen pro Replikat zu ergeben, und 300 µl sHB wurden zu jeder gepoolten Probe hinzugefügt. Um die Zellen zu lysieren, wurden die Proben 30 Sekunden lang gevortext und die Homogenate wurden 15 Minuten lang bei 20.817 × g und 4 °C zentrifugiert. Die Eierstöcke wurden in 300 µl sHB homogenisiert und ebenfalls zentrifugiert. Um die Proben vorab zu klären, wurden die Überstände in neue Röhrchen überführt, jedem Überstand wurden 20 µl gewaschene Perlen zugesetzt und die Proben wurden 30 Minuten lang bei 4 °C auf einem Rotor inkubiert. Zum Entfernen der Perlen wurde ein Magnetgestell verwendet, und 30 µl (10 %) jedes vorgereinigten Lysats wurden gesammelt und zu 250 µl RLT-Puffer (Qiagen, 74034), ergänzt mit 1 mM DTT, hinzugefügt, um als Eingangsproben zu dienen. Die Eingangsproben wurden eingefroren und bis zur RNA-Extraktion bei –80 ° C aufbewahrt. Insgesamt wurden jedem Extrakt 4 µl (4 µg) Anti-HA.11-Epitop-Tag-Antikörper (1/75, Invitrogen, 26183) zugesetzt und alle Proben 4 Stunden lang auf einem Rotor bei 4 °C inkubiert. Den Proben wurden 30 Mikroliter gewaschene Perlen zugesetzt und über Nacht auf einem Rotor bei 4 °C inkubiert. Die Perlen (jetzt durch HA-markierte Ribosomen und die zugehörigen mRNAs gebunden) wurden viermal in 750 µl Harnstoff-Waschpuffer (uWB: 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM KCl, 12 mM MgCl2, 1 % v/v NP) gewaschen -40, 1× Proteaseinhibitoren, 1 mM DTT, 40 U RNaseOUT, 40 U RNasin, 100 µg/ml Cycloheximid und 1 M Harnstoff) auf einem Rotor bei 4 °C für 10 Minuten pro Waschgang. Die Perlenaufschlämmung wurde dann in frische Röhrchen überführt, über ein Magnetgestell pelletiert und der uWB entfernt. Um den mRNA-Komplex von den Perlen zu entfernen, wurden jeder Probe 250 µl RLT-Puffer, ergänzt mit DTT, zugesetzt und die Proben 30 s lang gevortext. Schließlich wurden die Perlen pelletiert und entfernt, bevor die RNA-Extraktion mit dem Rneasy Plus Micro Kit (Qiagen, 74034) durchgeführt wurde. Die Proben wurden in 14 µl RNase-freiem Wasser eluiert und anschließend für die RNA-Seq- oder RT-qPCR-Analyse verwendet.

RiboTag-RNA-Proben wurden zur Qualitätskontrolle mithilfe eines Bioanalyzers (Agilent) und zur Vorbereitung der cDNA-Bibliothek an den Genomics Core des Gladstone Institute geschickt. cDNA wurde mit dem Ovation RNA-Seq System V2 Kit (NuGEN, 7102) hergestellt, das eine proprietäre Kombination aus Enzymen und Primern verwendet, um bevorzugt Nicht-rRNA-Sequenzen zu primen. Die Erststrang-cDNA-Synthese wird mit zufälligen Hexamer-Primern und chimären Poly(T)-Primern erreicht, die an die Region binden, die das Ende des 3'-UTR und den Anfang des Poly(A)-Schwanzes umfasst. Da stabile mRNAs mindestens 20 Adenosinreste aufweisen, ermöglicht die Verwendung dieser chimären Poly(T)-Primer das bevorzugte Priming von adenylierten Nachrichten (mRNAs) mit minimaler Tendenz für Nachrichten mit längeren Poly(A)-Schwänzen. RNA-Seq-Bibliotheken wurden mit dem Ovation Ultralow System V2 (NuGEN, 0344) erstellt und mit Bioanalyzer analysiert, mit qPCR (Kapa Biosystems, KR0405) quantifiziert und mit dem HiSeq 4000-System (Illumina) sequenziert.

Die Qualität der Rohsequenzdaten wurde über FASTQC überprüft. Die Sequenzdateien wurden dann mit Tools in Trimmomatic 0.3664 zugeschnitten. Folgendes wurde entfernt: Single-Ended-Adaptersequenzen von Illumina TruSeq3, Basen mit einem Qualitätsfaktor <3 am Anfang und Ende eines Lesevorgangs, Basen mit einer durchschnittlichen Qualität pro Base von <15, berechnet mithilfe eines Schiebefensters, um den Durchschnitt von vier Basen zu ermitteln, und alle Reads, die kürzer als 36 Basen waren. Die Lesevorgänge waren Single-Ended und die Qualität bestand aus ASCII-Zeichen, die der Phred-Qualität plus 33 entsprachen.

HiSat265 wurde verwendet, um Indizes aus dem Reference Consortium Mouse Build 38 (mm10) zu erstellen und Sequenzablesungen an das Genom anzupassen. Die resultierenden .bam-Dateien wurden mit SAMtools66 sortiert und indiziert. Zähldateien für jede Gruppe wurden mit HTSeq unter Verwendung des Maus-GENCODE-Gensatzes M11 erstellt. Die Eingabedaten waren.bam-Dateien, die Daten stammten nicht aus einem strangspezifischen Assay und der verwendete Merkmalstyp war „Gen“.

Für statistische Analysen wurden die Bioconductor-Pakete edgeR67 und limma68 verwendet. Es wurden nur Lesevorgänge mit größer oder gleich 10 Zählungen pro Million Lesevorgänge (CPM) in mindestens zwei Proben aufbewahrt. Anschließend wurde die Normalisierung des getrimmten Mittelwerts der M-Werte (TMM), die Zusammensetzungsunterschiede zwischen den Bibliotheken berücksichtigt, getrennt für HA-Lesevorgänge und Eingabe-Lesevorgänge durchgeführt. Unter Verwendung der Rohzahlen, der Streuung und der Designmatrix wurde das negative binomiale verallgemeinerte lineare Modell für jedes Gen angepasst. Schließlich wurden paarweise Likelihood-Ratio-Tests für Jung und Alt durchgeführt. Die Translationseffizienz wurde anhand des Verhältnisses der im RiboTag-Pellet (HA-IP) gewonnenen mRNA-Menge zur gesamten in der Eizelle vorhandenen mRNA (Eingabe) berechnet.

Genlisten wurden auf DAVID 6.869,70 hochgeladen und mit dem Functional Annotation Tool verarbeitet.

Das entsprechende Volumen (80 µl pro Probe) Dynabeads™ Protein G wurde zweimal in 250 µl unvollständigem Lysepuffer (iLB: 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5 % v/v NP-40) gewaschen , 0,25 mM Na3VO4 und 10 mM β-Glycerophosphat) auf einem Rotor bei 4 °C für 5 Minuten pro Waschgang. Zwei zusätzliche Waschgänge wurden mit 250 µl komplettem LB (cLB: iLB ergänzt mit 5× HALT-Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 80 U/ml RNAseOUT, 80 U/ml RNasin und 2× Ribonukleosid-Vanadyl-Komplex) auf einem Rotor bei 4 °C durchgeführt 5 Minuten pro Waschgang bei C waschen. Die letzte Waschlösung wurde entfernt und die Perlen wurden mit cLB bis zum ursprünglichen Volumen eluiert. Zweihundert Wildtyp-GV-Oozyten wurden in 10 µl 0,1 % w/v PVP und 250 U RNAseOUT in 1× PBS gesammelt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert. Um die Zellen zu homogenisieren, wurden 300 µl cLB hinzugefügt, die Proben wurden 30 Sekunden lang gevortext und dann 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Homogenate wurden dann 15 Minuten lang bei 20.817 × g bei 4 °C zentrifugiert und die Überstände in neue Röhrchen überführt. Insgesamt wurden 30 µl (10 %) jedes Überstands in 250 µl RLT-Puffer, ergänzt mit 1 mM DTT, als Eingangsproben aufbewahrt und das verbleibende Volumen zu gleichen Teilen in CPEB1-IP und IgG-IP (Kontrolle) aufgeteilt. Das Volumen jeder Probe wurde mit cLB auf 300 µl erhöht, 4 µl (4 µg) des entsprechenden Antikörpers (1/75, Anti-CPEB1: Abcam, ab73287 und Kontroll-IgG: Millipore, 12-371) wurden jedem Röhrchen zugesetzt und die Proben wurden 4 Stunden lang bei 4 °C auf einem Rotor inkubiert. Dann wurden 30 Mikroliter gewaschene Perlen in jedes Röhrchen gegeben und die Proben wurden über Nacht bei 4 °C auf einem Rotor inkubiert. Die Perlen jeder Probe wurden mit einem Magnetgestell pelletiert und viermal auf einem Rotor bei 4 °C mit 750 μl Waschpuffer (WB: 30 mM Tris-HCl pH 7,4, 200 mM KCl, 10 mM MgCl2, 0,5 % v/) gewaschen. v NP-40, 0,25 mM Na3VO4, 10 mM β-Glycerophosphat, 1× HALT-Proteaseinhibitor, 1 mM DTT, 1 M Harnstoff, 50 U/ml RNaseOUT und 50 U/ml RNasin) für 10 Minuten pro Waschgang. Nach jedem Waschen wurden die Perlen pelletiert und das WB entfernt. Die Proben wurden in ein sauberes Röhrchen überführt und jeder Probe wurden 250 µl RLT-Puffer, ergänzt mit 1 mM DTT, zugesetzt. Die Proben wurden 30 s lang verwirbelt, die Perlen pelletiert und entfernt. Die RNA-Extraktion wurde gemäß dem Qiagen Rneasy Plus Micro Kit-Protokoll durchgeführt. Die Proben wurden in 14 µl RNase-freiem Wasser eluiert und für die nachfolgende RT-qPCR-Analyse verwendet.

Extrahierte RNA wurde unter Verwendung des SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System mit zufälligen Hexamer- oder Oligo-dT-Primern (Invitrogen, 18080-051) revers transkribiert. Die Genexpression wurde mit TaqManTM Assays und TaqmanTM Fast Advanced Master Mix (ThermoFisher, 4444557) gemessen. Die verwendeten TaqMan-Assays waren wie folgt; ActB (Mm02619580_g1), Ccnb1 (Mm03053893_gH), Ccnb2 (Mm01171453_m1), Cpeb1 (Mm01314928_m1), Dppa3 (Mm01184198_g1), Eif4a1 (Mm03807704_g1), Gata4 (Mm0 0484689_m1), Golph3 (Mm00499420_m1), Il7 (Mm01295803_m1), Nlrp5 (Mm01143609_m1), Thumpd1 (Mm00524010_m1), Tpx2 (Mm01245970_m1), Sirt1 (Mm01168521_m1), Sirt7 (Mm01248607_m1), Rpl19 (Mm02601633_g1) und Zp3 (Mm00442176_m1). Vorläufige qPCRs wurden durchgeführt, um die unveränderten mRNA-Spiegel in GV- und MII-Oozyten zu testen. Unter den getesteten Genen wurden Actb und Eif4a1 in GV und MII in ähnlichen Mengen exprimiert, wenn zufällige Hexamere für das RT-Priming verwendet wurden, während Dppa3 und Rpl19 stabil waren, wenn Oligo(-dT) verwendet wurde. Da sich herausstellte, dass keine Gene unter beiden Priming-Bedingungen stabil waren, verwendeten wir das geometrische Mittel der vier besten Kandidaten für die beiden Priming-Bedingungen und es wurden keine Unterschiede in den Ct-Werten weder für das meiotische Stadium noch für die Priming-Methode beobachtet (N = 6; gepaarte, einfaktorielle ANOVA). Daher wurde in allen Experimenten mit qPCR das geometrische Mittel von Actb, Eif4a1, Dppa3 und Rpl19 Ct zur Datennormalisierung verwendet. Zehn Mikroliterreaktionen wurden auf dem QuantStudio 6 Flex Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die Genexpression wurde mit der 2-Ct-Methode quantifiziert und die statistische Analyse erfolgte mit GraphPad Prism 8.

Die offenen Leserahmensequenzen Ccnb1, Ccnb2, Golph3, Il7, Nlrp5, Thumpd1 und Tpx2 3'-UTR und Cpeb1 (Ergänzungsdaten 3) wurden durch Amplifikation von mRNA aus Eizellen mit geeigneten Primern erhalten (Ergänzungsdaten 4). YFP-Reporter, mCherry- und FL-Reporter wurden im pcDNA 3.1-Vektor subkloniert und RL-Reporter im pRL-TK-Vektor präpariert. Beide enthielten einen T7-Promotor, der die In-vitro-Transkription zur Synthese von mRNAs ermöglicht. Die Genauigkeit wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Alle Reporter fügten am 3-Fuß-Ende einen Abschnitt von 20A hinzu. Der mCherry-Reporter wurde in vitro polyadenyliert und enthielt einen Poly(A)-Schwanz von 150–200 A. mRNA-Reporter wurden in vitro transkribiert, um mRNAs mit dem mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit (Ambion, AM1344) zu synthetisieren; Die Polyadenylierung von mCherry- und Firefly-Luciferase wurde mit dem Poly(A) Tailing Kit (Ambion, AM1350) durchgeführt. Alle Nachrichten wurden mit dem MEGAclear Kit (Ambion, AM1908) gereinigt. Die mRNA-Konzentrationen wurden mit NanoDrop gemessen und ihre Integrität durch Elektrophorese bewertet.

Eizellen, die noch in den Kumuluszellen eingeschlossen waren (CEOs), wurden mit 12,5 ng/µl Il7-RL, Thumpd1-RL oder Tpx2-RL und 12,5 ng/µl polyadenyliertem FL unter Verwendung eines programmierbaren FemtoJet Express-Mikroinjektors mit einem automatisierten aufrechten Mikroskopsystem injiziert ( Leica, DM4000B). Injizierte CEOs wurden 3 Stunden lang in Kulturmedium, ergänzt mit 2 μM Milrinon, vorinkubiert und dann in milrinonfreiem Medium, ergänzt mit 100 nM Amphiregulin, kultiviert. Nach 16 Stunden wurden die CEOs entblößt, in Lysepuffer gesammelt und eingefroren. Die Luciferase-Aktivitäten in den Eizellenextrakten wurden mit einem Dual-Luciferase-Reporter-Assay-Kit (Promega) gemessen und die Lumineszenz wurde mit einem SpectraMax L-Luminometer (Molecular Devices) nachgewiesen. Die Daten werden als Verhältnisse von RL und FL angegeben.

Ccnb1-YFP, Ccnb2-YFP, Il7-YFP, Golph3-YFP, Thumpd1-YFP oder Tpx2-YFP wurden in Oozyten mit 12,5 ng/µl mit polyadenyliertem mCherry mit 12,5 µg/µl unter Verwendung eines programmierbaren FemtoJet Express-Mikroinjektors mit automatisiertem System injiziert Aufrechtes Mikroskopsystem. Nach 3-stündiger Vorinkubation oder über Nacht in α-MEM-Medium mit 1 µM Cilostamid wurden die Eizellen zur In-vitro-Reifung in Cilostamid-freies Medium freigesetzt oder mit Cilostamid inkubiert, um den GV-Status aufrechtzuerhalten. Zeitrafferaufnahmen wurden mit einer Nikon Eclipse T2000-E durchgeführt, die mit einem mobilen Tisch und einer Umgebungskammer bei 37 °C und 5 % CO2 mit den folgenden Einstellungen ausgestattet war: Filtersatz, dichroitischer Spiegel YFP/CFP/mCherry 69008BS; Ypet-Kanal (Beispiel: S500/20×49057 Em: D535/30 m 47281); und mCherry-Kanal (Bsp.: 580/25×49829 Em: 632/60 m). Die Bilder wurden verarbeitet und die Fluoreszenz wurde mit MetaMorph (Molecular Devices) quantifiziert. Die Verhältnisse des YFP-Reporters zum Plateauniveau des mCherry-Signals wurden als Proteinakkumulation während der Eizellenreifung angegeben. Die Übersetzungsrate wurde mit YFP/mCherry-Verhältnissen als Steigung der einfachen linearen Regressionskurve im angegebenen Zeitintervall berechnet.

Eizellen wurden in 30 µl 2× Kinasepuffer (100 mM HEPES, 30 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 10 mM CaCl2, 2 mM DTT, 2 µg/ml Leupeptin, 2 µg/ml Aprotinin, 2 µM Okadainsäure) gesammelt. Die Eizellen wurden durch zweimaliges Einfrieren und Auftauen in flüssigem Stickstoff lysiert. Die Extrakte wurden 30 Minuten lang bei 30 °C in Gegenwart von 0,1 mM ATP, 10 mM DTT, 2 µM Okadainsäure und 2 µg des rekombinanten Peptids GST-PP1 als Substrat inkubiert. PP1-GST wurde wie zuvor beschrieben hergestellt47. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von Laemmli-Probenpuffer und 5-minütiges Kochen bei 95 °C gestoppt. Die CDK1-Aktivität wurde durch Quantifizierung des Western-Blot-Signals von phosphoryliertem T320 des gesamten geladenen Substrats gemessen, das durch Ponceau-S-Färbung bewertet wurde.

Eizellen wurden in 10 µl 0,1 % w/v PBS/PVP mit 4 µl Laemmli-Puffer (Bio-Rad, 161-0747) mit β-Mercaptoethanol (Gibco 21985023), einem Phosphatase-Inhibitor und Protease-Inhibitor, lysiert. Die Eizellenlysate wurden 5 Minuten lang bei 95 °C gekocht und auf Eis belassen, dann auf 10 % v/v oder 12 % v/v Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Millipore ISEQ00010) übertragen. Die Membranen wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in 5 %iger Milch blockiert und über Nacht bei 4 °C mit primärem Antikörper inkubiert. Der primäre Antikörper und die verwendeten Verdünnungen waren wie folgt: CPEB1 (Abcam, ab73287, 1:1000), α-Tubulin (Sigma-Aldrich, T6074, 1:10.000), T320-pp1 (Abcam, ab62334, 1:30.000). Die Membranen wurden in TBS-Tween 20 (0,05 % v/v) gewaschen und mit HRP-konjugierten Sekundärantikörpern, 1:10.000 Anti-Kaninchen-IgG (GE Healthcare, NA934V) und 1:10.000 Anti-Maus-IgG (GE Healthcare NA931V) inkubiert. , für 2 h bei Raumtemperatur. Die Signale wurden mit Clarity Western ECL-Substrat (Bio-Rad, 170-5061) nachgewiesen. Die Bilder werden mit dem ImageJ 1.53a analysiert.

Die statistische Analyse wurde mit dem Paket GraphPad Prism 9.3.1 durchgeführt. Die durchgeführte statistische Analyse hing von einem bestimmten Experiment ab und wird in der Legende der Abbildung beschrieben. Für den Vergleich zwischen zwei Gruppen wurde ein zweiseitiger gepaarter oder ungepaarter t-Test verwendet, für den Mehrfachvergleich wurde eine einfaktorielle ANOVA verwendet. Die statistische Signifikanz wird in jedem Diagramm durch ein Sternchen gekennzeichnet. Die Qualität der RNA-Seq-Reads wurde mit FastQC durchgeführt und die Reads wurden dann mit Trimmomatic 0.36 getrimmt. Die Ausrichtung der Lesevorgänge am Mausgenom wurde von Hisat2 durchgeführt, .bam-Dateien wurden mit Samtools sortiert und indiziert und Zähldateien wurden von HTSeq generiert. Die TMM-Normalisierung und die verbleibenden statistischen RNA-Seq-Analysen wurden über EdgeR durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

RiboTag-IP/RNA-Seq-Daten wurden in der NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank unter dem Zugangscode GSE222638 hinterlegt. Die in dieser Arbeit verwendeten veröffentlichten verfügbaren Datensätze stammten von der NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)-Zugangsnummer GDS3295 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE11667] (Aging transcriptome24 ), GSE35106 (Polysome array14), GSE135525 (RiboTag IP/RNA-Seq15), GSE165782 (PAIso-seq71) und GRCm38 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000001635.20] (Maus Genomdatensatz). Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Eine Korrektur zu diesem Artikel wurde veröffentlicht: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36396-1

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Wir danken Dr. Raúl Méndez und Dr. Gonzalo Fernandez-Miranda (The Barcelona Institute of Science and Technology) für die Bereitstellung der CPEB1-zielgerichteten Mäuse sowie Dr. Chisato Kunitomi und Hong Kung Li für die Probenentnahme. Diese Arbeit wurde vom NIH/NICHD P50 HD055764 Center for Research and Innovation and Training in Reproduktion and Infertility, dem NIH R01 GM116926, unterstützt. Dieses Projekt wurde teilweise durch die Fördernummer GCRLE-1020 des Global Consortium for Reproductive Longevity and Equality am Buck Institute finanziert, ermöglicht durch die Bia-Echo Foundation. Die Autoren danken dem UCSF Bakar Aging Research Institute für die Unterstützung beim Kauf alter Mäuse und Dr. Leanne Jones und Saul Villeda für die hilfreiche Diskussion.

Federica Franciosi

Aktuelle Adresse: Labor für Reproduktions- und Entwicklungsbiologie, Abteilung für Veterinärmedizin und Tierwissenschaften, Università degli Studi di Milano, 20133, Mailand, Italien

Enrico Maria Daldello

Aktuelle Adresse: Universität Sorbonne, CNRS, Labor für Entwicklungsbiologie – Institut de Biologie Paris Seine, LBD-IBPS, Paris, Frankreich

Zentrum für Reproduktionswissenschaften, University of California, San Francisco, CA, 94143, USA

Nozomi Takahashi, Federica Franciosi, Enrico Maria Daldello, Xuan G. Luong, Peter Althoff, Xiaotian Wang und Marco Conti

USA Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California, San Francisco, CA, 94143, USA

Nozomi Takahashi, Federica Franciosi, Enrico Maria Daldello, Xuan G. Luong, Peter Althoff, Xiaotian Wang und Marco Conti

Abteilung für Geburtshilfe, Gynäkologie und Reproduktionswissenschaften, University of California, San Francisco, CA, 94143, USA

Nozomi Takahashi, Federica Franciosi, Enrico Maria Daldello, Xuan G. Luong, Peter Althoff, Xiaotian Wang und Marco Conti

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MC hat die Studie entworfen. NT, FF, EMD, XGL, PA und XW führten Experimente durch. NT und MC analysierten die Daten. NT und MC haben den ersten Entwurf des Papiers verfasst und alle Autoren haben zu seiner Überarbeitung beigetragen.

Korrespondenz mit Marco Conti.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Mirko Völkers und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Takahashi, N., Franciosi, F., Daldello, EM et al. CPEB1-abhängige Störung des mRNA-Translationsprogramms in Eizellen während des mütterlichen Alterns. Nat Commun 14, 416 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-35994-3

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Eingegangen: 12. April 2022

Angenommen: 11. Januar 2023

Veröffentlicht: 26. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-35994-3

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